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1.準(zhǔn)備好37°C水??；

2.超凈臺(tái)中，取5mL人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（可根據(jù)實(shí)際復(fù)蘇的細(xì)胞量選擇培養(yǎng)容器與培養(yǎng)基體積），并將培養(yǎng)瓶置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min；

3.超凈臺(tái)中，取10mL人間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基于15mL離心管中，待用；

注意：無需將人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基預(yù)先水浴至37°C，以免影響培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子的活性。

4.從液氮中取出凍存的人間充質(zhì)干細(xì)胞，迅速將凍存管置于37°C溫水中，并快速晃動(dòng)凍存管，使其內(nèi)含物盡快融化，待凍存管內(nèi)含物融化完全后取出；

注意：

1）盡可能將凍存管的內(nèi)含物全部浸沒于37°C溫水中，使內(nèi)含物均勻融化；

2)    請(qǐng)勿使溫水沒過凍存管蓋的螺口以防污染;

3)    細(xì)胞復(fù)蘇的操作過程要迅速，避免影響細(xì)胞復(fù)蘇后的活性。

5.在將凍存管拿進(jìn)超凈臺(tái)之前，用75%酒精對(duì)其表面進(jìn)行消毒；

6.輕輕重懸細(xì)胞，并將其移入待用的裝有10mL人間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基的15mL離心管里；

7.用1mL培養(yǎng)基再次沖洗凍存管，并將此懸液移至離心管中，輕輕吹打混勻；

8.室溫下，300g離心10min；

9.傾去上清，往沉淀加入2-3mL的人間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，輕輕吸打均勻；

10.從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出已預(yù)先孵育30min的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)瓶中的液體；

11.將細(xì)胞按0.8-1.0×104個(gè)活細(xì)胞/cm2的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入足量的人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分布均勻；

12.將細(xì)胞置于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

13.第二天，更換新鮮的人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基；

14.每隔兩天更換一次新鮮的培養(yǎng)基，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90%的匯合度。