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1.將PBS，胰酶置于37°C水浴鍋中預(yù)熱；

2.超凈臺中，吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液；

3.輕輕加入5mLPBS于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動洗滌細(xì)胞后吸去PBS，共洗滌兩次；

4.加入2mL濃度為0.05%的胰酶，輕輕晃動，使胰酶溶液均勻覆蓋培養(yǎng)瓶底面。顯微鏡下，當(dāng)70-80%的細(xì)胞變圓時輕拍培養(yǎng)瓶，并立即加入10mL人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行中和。輕輕吸取瓶內(nèi)液體反復(fù)沖洗瓶底，使細(xì)胞完全脫落；

注意：

1）吹打時動作要輕，避免損傷細(xì)胞；

2）建議使用濃度為0.05%的胰酶，并且消化時間不宜過長，以減少胰酶對干細(xì)胞的損傷。

5.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，300g離心10min；

6.小心去除上清，而后加入10mLPBS重懸細(xì)胞沉淀，并再次300g離心10min；

7.小心去除上清，加入2-3mL人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按1：2或1：3的比例接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再次加入足量的完全培養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分布均勻；

8.將細(xì)胞置于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。